Examinando por Autor "Conejeros Abraham, Pablo (Director de tesis)"

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    Derivación de un aptamero de DNA como un sistema aplicado para detección de una toxina marina
    (Universidad de Valparaíso, 2014) Alfaro Arancibia, Karol; Conejeros Abraham, Pablo (Director de tesis)
    No se sabe bien las condiciones que influyen para que ocurran las Floraciones Algales Nocivas (FAN), fenómeno natural provocado por la proliferación de especies de microalgas, una reproducción excesiva, cuyas concentraciones de algunas especies causan daño a otro organismo acuático. Se cree que es por el incremento de temperatura, incremento de la luminosidad, agotamiento de la disponibilidad de nutrientes, poca turbulencia del agua y condiciones hidrográficas, por ejemplo cuyos suelos son áridos y aportan minerales al agua provocando una mayor turbidez del agua alterando la actividad fotosintética, para facilitar a la aparición de cianobacterias. Las mareas rojas producidas en Chile se deben principalmente a una especie llamada Alexandrium Catenella, que es un dinoflagelado que produce una de las toxinas más peligrosas conocidas, pertenecientes al grupo del Veneno Paralizante de Marisco, correspondiente a análogos de Saxitoxina. Los crecimientos poblacionales de este microorganismo en agua dulce o salada causa enormes pérdidas económicas que bordean los 50 millones de dólares anuales solo en Chile. El método tradicional para el monitoreo de concentraciones de PSP es el ensayo biológico con ratones de la línea CF-1, que presenta propiedades biológicas homogéneas y constantes en el tiempo, relacionando la toxicidad de las muestras de marisco con el tiempo de muerte después de haber inyectado intraperitonealmente, un pequeño volumen de extracto crudo de marisco. Sin embargo este método requiere de personal especializado e infraestructura costosa, la cual restringe los análisis a unos pocos laboratorios. Además, este sistema que es válido internacionalmente y normado en Chile presenta ciertas desventajas. Entre ellas se encuentra que es poco selectivo, presenta una baja sensibilidad, especificidad reducida, se necesita un gran stock de animales y presenta errores al testear concentraciones bajas de toxinas. Estas limitaciones han conducido a desarrollar otros tipos de ensayos que sean menos costosos de implementar, y puedan ser ocupados donde haya un dificil acceso geográfico, para poder realizar detecciones preventivas. Los llamados aptámeros, moléculas de hebra simple de ADN o ARN que son altamente sensibles, específicos, con una alta afinidad y con un manejo sencillo, podrían tener la capacidad de compensar las exigencias que se requieren para poder desarrollar nuevos sistemas analiticos de detección de VPM. En el año 2012 se desarrolló un aptámero que se une en forma especifica a Saxitoxina. Sin embargo no se ha encontrado un sistema aplicable para este aptámero. En este trabajo se propone derivar este aptámero en un sistema que detecte de forma específica a Saxitoxina, que permita un cierto grado de automatización. Aplicando un método nuevo y sencillo llamado High Resolution Melting, se puede generar con el uso de fluoróforos un ensayo el cual se podrá ejecutar en solo paso con el uso de equipos que puedan registrar fluorescencia, el cual podrá ser aplicado en diversos laboratorios a lo largo del país que poseen este tipo de de intrumentos.
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    Desarrollo de aptámeros de alta afinidad por gonyautoxina mediante selección in vitro
    (Universidad de Valparaíso, 2015) Figueroa Grenett, Franco; Conejeros Abraham, Pablo (Director de tesis)
    Los florecimientos algales nocivos (FAN) se presentan en todos los océanos del mundo y las microalgas que constituyen las FAN son habituales de los ecosistemas acuáticos. Su efecto nocivo se debe a las toxinas presentes en éstas y son las responsables del veneno paralizante de molusco (VPM). Estas toxinas son concentradas en organismos acuáticos filtradores de microalgas, como moluscos bivalvos, los que al ser consumidos por humanos provocan serios daños a la salud e incluso la muerte. El envenenamiento provocado por el consumo de moluscos es una patología causada por la saxitoxina y sus más de 26 análogos. Dentro de las toxinas paralizantes la gonyautoxina (GTX) es la que se encuentra en mayor porcentaje en el VPM en Chile. Además estas floraciones han llegado a transformase en un serio problema para salud pública y la economía local. Actualmente muchos de los ensayos disponibles para detección de VPM emplean anticuerpos o animales vivos. Y el más recurrente para detectar saxitoxina es el ensayo ratón. Esta tesis se centró en el desarrollo de aptámeros contra gonyautoxina para un futuro sistema de detección que aporte a los retos asociados a la limitada disponibilidad de anticuerpos y el uso de animales. El procedimiento consistió en una selección in vitro de aptámeros mediante la metodología de SELEX convencional que utilizó perlas magnéticas para la inmovilización del objetivo. En contraparte se realizó una novedosa variante de SELEX al que se llamó alternativo, que utilizó la molécula de gonyautoxina libre, presentado ventajas relacionadas con la rentabilidad y la reducción de tiempo de ensayo. En esta tesis se muestran posibles aptámeros dirigidos a gonyautoxina que fueron obtenidos mediante SELEX convencional y alternativo. Estos se caracterizaron por medio de curvas de fusión de alta resolución, análisis de secuencias y predicción de estructuras plegables, y puede observarse una alta similitud entre ellos. Se prevé que si efectivamente son aptámeros afines a Gonyautoxina, esta tesis contribuiría con el desuso ensayos costosos como el uso de anticuerpos y/o ensayos que perjudiquen el bienestar animal.