Biophysical study of the endoplasmic reticulum master regulator protein, bip, as a molecular motor

La translocación de proteínas hacia el retículo endoplásmico (RE) es un proceso celular fundamental, esencial para el correcto plegamiento, modificación y direccionamiento de las proteínas secretoras y de membrana. En eucariotas, este proceso ocurre mediante mecanismos cotraduccionales o postraduccionales; estos últimos son responsables de la translocación de proteínas al RE. A pesar de su importancia biológica, la vía postraduccional sigue siendo desconocida. El translocón Sec61 constituye el canal central por el que los polipéptidos atraviesan la membrana del RE. La chaperona residente del RE, BiP (por sus siglas en inglés, immunoglobulin binding protein), miembro de la familia Hsp70, desempeña un papel clave en este proceso al interactuar tanto con el sustrato polipeptídico como con el complejo Sec62/Sec63 asociado a Sec61, utilizando la energía derivada de la hidrólisis de ATP para facilitar la translocación y el plegamiento en el lumen del RE. Sin embargo, el mecanismo mecanoquímico mediante el cual BiP opera durante este proceso sigue siendo objeto de debate. Se han propuesto dos modelos: un trinquete browniano (Brownian ratchet) pasivo, en el que BiP impide el retroceso del polipéptido sin generar una fuerza mecánica mayor que la del baño térmico; y un modelo activo de golpe de potencia (power stroke), en el que BiP convierte la energía química en trabajo mecánico para impulsar el sustrato a través del canal. Un estudio reciente de molécula única demostró que la secuencia señal del precursor del factor alfa (ppαF) permanece asociada al complejo Sec61 durante aproximadamente 17 segundos, lo que sugiere una ventana temporal en la que BiP puede interactuar de manera productiva con el dominio J de Sec63. Aunque el papel exacto del dominio J aún no está completamente definido, se ha propuesto que la interacción entre BiP y el dominio J de Sec63 reduce la especificidad de BiP para sus sustratos, lo que le permite unirse a regiones extendidas de la cadena polipeptídica. En contraste, BiP en solución reconoce preferentemente un motivo consenso definido, Hy(WX)HyXHyXHy, donde Hy representa un residuo aromático o hidrofóbico voluminoso, W corresponde a triptófano y X puede ser cualquier aminoácido. Mediante el análisis de la cinética de translocación, caracterizamos la función motora de BiP mediante ensayos de protección frente a la proteasa in vitro utilizando microsomas de Saccharomyces cerevisiae y proteínas quiméricas diseñadas que contienen todos los componentes necesarios para la translocación postraduccional. Para ello, diseñamos constructos quiméricos compuestos por un péptido señal (reconocido por Sec61), una región desplegada (Dominio I27 mutante de Titina) que confiere competencia para la translocación y un dominio plegado correspondiente a una proteína de alta o baja fuerza de desplegamiento, previamente reportados en la literatura mediante pinzas ópticas (optical tweezers). En primer lugar, se utilizó como control positivo una proteína quimérica compuesta por dos dominios del dominio I27 mutante de Titina en el ensayo de protección frente a proteasas, la cual se translocó hacia los microsomas a una tasa de 0,61 %/min. Por el contrario, la proteína quimérica de Top7 (que requiere 20 pN para su desplegamiento) no mostró translocación detectable, mientras que la quimera de calmodulina, cuyo desplegamiento ocurre a 7 pN, exhibió una tasa de translocación de 0,03 %/min. Esta baja eficiencia de translocación in vitro sugiere que BiP no ejerce fuerzas suficientes para desplegar las proteínas y permitir su translocación. Además, el trabajo mecánico estimado y la potencia de salida fueron comparables a la energía térmica local y de órdenes de magnitud menores que los de motores moleculares de tipo activo (power stroke) bien caracterizados, respectivamente. En conjunto, sugerimos que estos resultados descartan un mecanismo en el que BiP genera un trabajo mecánico sustancial para traccionar y desplegar los sustratos en translocación y, en su lugar, respaldan un mecanismo de tipo trinquete (ratchet) para la translocación de proteínas mediada por BiP.