Examinando por Autor "Schmachtenberg, Oliver (Director de tesis)"
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Ítem Analisis of the cellular and molecular organization of the lactate shuttle in the inner retina(Universidad de Valparaíso, 2022-01) Calbiague García, Víctor; Schmachtenberg, Oliver (Director de tesis)Metabolism is a fundamental issue for cell function. This becomes an important concern for the nervous system and, therefore, for neurons, since excitatory synapses consume almost 50% of ATP to restore the ion gradients challenged by depolarization. The retina shares several features with the brain, including its high energy demands. Nonetheless, it is known that the retina metabolizes glucose mainly by the energetic-inefficient aerobic glycolysis pathway, which is 18- fold less productive than oxidative phosphorylation and has as its final step the production of lactate. Many investigations have suggested the existence of a retinal lactate shuttle, but to date the possible cells that consume this extracellular lactate which is produced by aerobic glycolysis remain unclear. The aim of this study was to better understand the energy metabolism in the retina and especially propose a consumption of extracellular lactate as an alternative energy source for inner retinal cells. Immunofluorescence experiments showed that the inner retina massively expressed a specific monocarboxylate transporter isoform (MCT2). Moreover, this transporter colocalizes with the rod bipolar cell (RBC) marker, PKCα, and the amacrine cell marker, calretinin. To test the functionality of this expression we cultured retinal explants, and we manipulated pharmacologically the lactate metabolism for 4 days. These different treatments altered the death cell rate and number of RBCs. Furthermore, calcium and sodium imaging experiments reveal that the inhibition of lactate transport disrupts the ion gradients, resulting in changes in intracellular levels of basal calcium and sodium, that alter the amplitude, and kinetics parameters of calcium and sodium responses, suggesting a disruption in ion pumps. Interestingly, single-cell experiments reveal that the exposure of retinal slices to an extracellular solution with lactate, maintains the outward current, calcium current, and membrane potential. But the addition of an MCT2 blocker decreases the outward current, and calcium current and depolarizes RBCs. Finally, the study of intracellular lactate dynamics expressing the genetically-encoded FRET nanosensor Laconic, suggests that inner retinal neurons are capable of consuming extracellular lactate through MCT2 under culture basal conditions, which is exacerbated when the retina is subjected to general depolarization. Conversely, Müller cells display a producer profile under culture basal condition, which is reversed under a general depolarization. In conclusion, our data support the notion that inner retinal neurons can import a portion of the extracellular lactate through MCT2 to meet their physiological demands, specifically cellular survival, ion homeostasis, and currents. In parallel, other observations suggest that Müller cells produce lactate under basal culture conditions, so they could be one of the cell types performing aerobic glycolysis in the retina. Likely, this extracellular lactate is used by retinal bipolar cells to produce ATP by classic oxidative phosphorylation.Ítem Caracterización y análisis de la viabilidad celular en cultivos organotípicos de retina bajo condiciones normales y altas de glucosa y la contribución de moléculas antioxidantes(Universidad de Valparaíso, 2020) Cádiz Ramírez, Bárbara; Schmachtenberg, Oliver (Director de tesis)La retinopatía diabética (RD) es una complicación de la diabetes y una de las principales causas de ceguera en el mundo. La RD trae consigo un daño progresivo e irreversible en la retina que involucra activación de procesos inflamatorios, isquemia, cambios en la bioquímica neuronal, cambios morfológicos de células gliales y una sobreproducción de especies oxidativas capaces de alterar el funcionamiento celular. La sobreproducción de especies oxidantes se ha asociado a varias enfermedades neurodegenerativas que incluyen la RD, sin embargo, los mecanismos involucrados junto con la patogénesis de la enfermedad no han sido entendidos en profundidad. En este trabajo relacionamos la exposición de componentes celulares de la retina a altos niveles de glucosa y su efecto sobre la generación de estrés nitrosativo y la viabilidad celular . Para ello utilizamos un modelo de cultivos organotípicos de retina de rata que fueron cultivadas en condiciones moderadas y altas de glucosa por 7 y 14 días. Mediante estudios histológicos, microscopía de fluorescencia y electrónica, pudimos confirmar que la exposición directa de explantes de retina a altas concentraciones de glucosa produce un aumento de la muerte celular en los fotorreceptores a consecuencia de un aumento de estrés oxidativo-nitrosativo en la retina.Ítem Ensayos de toxicidad del veneno de loxosceles laeta en cultivos de fibroblastos humanos(Universidad de Valparaíso, 2017) Bertea Seissus, Constanza; Schmachtenberg, Oliver (Director de tesis)Loxosceles laeta es una especie que cohabita en nuestros hogares y que es de gran peligrosidad por ser la araña más venenosa de Sudamérica, debido a su potente veneno constituido por un grupo extenso de toxinas, donde la más estudiada se llama Fosfolipasa-D. Esta enzima escinde lípidos y genera con ello metabolitos que en muchos casos están asociados a vías de señalización celular, lo que resulta interesante ya que se ha demostrado que el cuadro generado por una mordedura es muy similar a la inoculación de esta enzima por sí sola. La mordedura de esta araña genera Loxoscelismo, un cuadro que puede ser local (cutáneo), desencadenando una respuesta inflamatoria que puede generar necrosis del área, o sistémico (cutáneo visceral), en el que se compromete el organismo habiendo daño renal y hepático, lo que puede causar la muerte. En Chile el 83 % de los casos reportados consiste en el cuadro cutáneo, mientras un 22,2% en niños y 19,1% en adultos trata del cutáneo- visceral teniendo una mortalidad del 1 al 3%. Aunque las mordeduras por arañas de rincón no son frecuentes y la mayoría de los casos no son graves, resulta sustancial el estudio de su veneno porque no existe una cura para remediar los síntomas del cuadro sistémico. Por lo anterior, se hizo un estudio para comprender el mecanismo de acción del veneno, adaptando un protocolo en donde se sedaron arañas hembras en CO2, y posteriormente se les extrajo y almacenó el veneno. Este veneno se utilizó en cultivos de fibroblastos humanos y a una concentración determinada se llevaron a cabo ensayos inmunocitoquímicos para estudiar la mantención de mitocondrias, núcleo, conexina 43, iNOS y el citoesqueleto de actina. Se pudo demostrar que el veneno de L. laeta en fibroblastos humanos posee una reacción variada que probablemente genera muerte celular por apoptosis, en donde el cambio en la morfología de la mitocondria y disminución de conexina 43 en aposición podría estar relacionado con ello. Por otro lado, se demostró que hay una vía inflamatoria asociada por el aumento en expresión de la enzima iNOS, la cual podría no estar asociada a muerte celular por necrosis sino a una respuesta a la toxina Fosfolipasa-D escindiendo uno de sus posibles sustratos lipídicos, la esfingomielina, la cual forma ceramida-1-fosfato, que se ha demostrado que es un factor en la liberación de NO por la vía inducible sintasa.Ítem Estudio de la expresión y activación por voltaje de canales de panexina-1 en células ganglionares de retina de ratón(Universidad de Valparaíso, 2013) Valdés Bize, Joaquín; Schmachtenberg, Oliver (Director de tesis)Las panexinas son una familia de proteínas de tres miembros descubiertas recientemente que forman canales de membrana. Aunque son estructuralmente similares a las conexinas se diferencian de estas al no compartir homología en sus secuencias. En varios tipos celulares, se ha descubierto que la Panexina-1 (Panx1) cumple funciones de mecanosensor, liberación de ATP, entre otras. Al demostrarse que están asociados a receptores P2X7 se ha relacionado la actividad de los canales de Panx1 con la formación de complejos proteicos asociados a respuestas inmunológicas. En la retina se ha demostrado una marcada expresión de Panx1 en la mayoría de sus capas, en particular en células ganglionares de la retina (CGR) donde se han relacionado con procesos patofisiológicos asociados con isquemia y glaucoma. En esta tesis, se propuso estudiar la expresión de Panx1 mediante inmunomarcaje con microscopía confocal y su función en la modulación de respuestas eléctricas en CGR. Se utilizó un protocolo propuesto de voltage clamp que por medio de rampas precondicionantes permitiría diferenciar corrientes de Panx1. Como controles para la inmunohistoquímica de retina se usaron ratones KO de Panx1. Para los registros electrofisiológicos se utilizaron ratones WT, bloqueadores de canales de Panx1 (carbenoxelona 5 µM y probenecida 200 µM) y células HeLa transfectadas con Panx1 como controles positivos. En la inmunohistoquímica se observó una marcación específica de Panx1 en la retina de ratones WT en la capa de células ganglionares (CCG) y la capa plexiforme interna (CPI). De manera controversial, se observó marcación específica de Panx1 en el ratón KO en las mismas capas del WT. Esto se puede atribuir a que la línea del ratón KO presenta un fenotipo hipomórfico de Panx1 (aprox. 50% de expresión) y no un KO global. En células HeLa y CGR el protocolo de voltage clamp no permitió observar corrientes específicas de Panx1. Sin embargo, al aplicar los bloqueadores de Panx1, se observaron leves variaciones en las corrientes evocadas a potenciales despolarizados en células HeLa y diferencias significativas solo en algunas condiciones al registrar CGR. En conclusión, los resultados de esta tesis indican que existe expresión de Panx1 en capas internas de la retina y que existe una leve modulación mediada por los canales de Panx1 de las respuestas eléctricas de CGR.Ítem Estudio de respuestas olfatorias en trucha arcoiris (oncorhynchus mykiss)(Universidad de Valparaíso, 2019-01) Olivares Dubart, Jesús; Schmachtenberg, Oliver (Director de tesis)La anatomía del sistema olfatorio en las diferentes especies de vertebrados guarda semejanzas importantes, haciendo de este un sistema sensorial altamente conservado por la evolución. El esquema básico presenta un epitelio olfatorio que capta el estímulo químico, un centro de procesamiento intermedio, que en vertebrados está representado por el bulbo olfatorio, y un centro de procesamiento superior, representado por regiones del telencéfalo en vertebrados. En peces como los salmónidos, este sentido es de vital importancia para tareas como la alimentación, el reconocimiento intra- e interespecífico, la orientación y migración y la detección de señales de alarma. Se ha descrito que el sistema olfatorio tanto de peces como de mamíferos presenta actividad neural de tipo oscilatoria, que se produce en respuesta a la estimulación con odorantes. Este fenómeno se presenta tanto en el bulbo olfatorio como en diferentes regiones telencefálicas, análogas entre las diferentes especies de vertebrados, pudiendo estar asociado a actividad cognitiva. En el presente trabajo, registramos en paralelo la actividad neural de tipo oscilatoria que se produce en tres sectores del sistema olfatorio de la especie Oncorhynchus mykiss, al estimular con olores naturales y sintéticos, para responder ¿Cuáles son las características básicas de las oscilaciones del potencial de campo local (LFP) registradas en el sistema olfatorio de truchas; qué factores las modulan y cuál es su importancia en la codificación olfatoria? Proponemos que las oscilaciones observadas en el LFP que se registra en el bulbo olfatorio (OB) y las regiones telencefálicas núcleo ventral de la región (Vv) y región dorsal posterior (Dp), reflejan actividad neuronal sincronizada entre estas regiones, mientras se procesa información olfatoria. No observamos diferencias en parámetros básicos de estas oscilaciones como la amplitud, duración y frecuencia, por el contrario, se observa que la frecuencia en la que se observa el máximo poder espectral está en la misma banda de frecuencia en diferentes animales, con diferentes estímulos odoríferos y con diferentes concentraciones. Se determinó que es necesario que el bulbo olfatorio esté conectado físicamente con el telencéfalo para que en el se generen oscilaciones evocadas por olores, sugiriendo que estas oscilaciones podrían ser de naturaleza similar a las oscilaciones beta () observadas en mamíferos. El análisis de los resultados muestra que existe un aumento en el poder espectral en bandas de frecuencia baja (< 12 Hz) y en bandas de frecuencia alta (> 15 Hz), observándose además que hay un alto grado de coherencia entre el OB y las regiones Vv y Dp del telencéfalo en estas bandas de frecuencia, demostrando una sincronización del procesamiento de la información olfatoria en estos vertebrados.Ítem Glucagon as a novel neuromodulator of retinal rod bipolar cell inhibitory activity, possible implications in myopia pathogenesis(Universidad de Valparaíso, 2022-09) Tapia Pérez, Felipe; Schmachtenberg, Oliver (Director de tesis)Myopia incidence is steadily increasing worldwide, but the underlying pathophysiologic mechanisms are still only partially understood. Glucagon is a peptide thought to signal image defocus in the eye, which is considered the first step in myopia induction, and dopamine is known for its key role in myopia, being proposed as the main signaling molecule linked to its pathogenesis. The aim of this study was to corroborate glucagon signaling in the mammalian retina and find a possible link with dopaminergic signaling. To this end, whole-cell patch-clamp and bath application of selective pharmacological agents were used to study the inhibitory activity of rod bipolar cells (RBCs), as this activity is known to be regulated by dopamine and has been linked in other parts of the central nervous system to regulation by members of the glucagon/secretin family, and also since RBCs have been implicated in glucagon-related activity. Inhibitory post-synaptic currents (IPSCs) under 0 mV voltage-clamp mode were measured in RBCs from wild-type and lens-induced myopia model mice. Glucagon produced a dose-dependent and glucagon receptor-dependent increase in RBC glycinergic IPSC frequency. This effect was also dependent on dopaminergic activity as it was abolished by dopamine type 1 receptor (D1R) antagonism and in scotopic conditions. The effect was also abolished in the myopia murine model but could be recovered using D1R agonism in model animals for up to 2 weeks of induction. Glucagon is a novel retinal neuromodulator in mammals, regulating the glycinergic inhibitory activity acting on RBCs in a D1R-dependent manner. Its effects are abolished in a myopia model, suggesting it is one of the pathways affected in this condition. More research will be required to determine whether this pathway could be a target for myopia prevention or treatment.Ítem La sensibilidad espectral visual de la araña de rincón (araña reclusa chilena) loxosceles laeta(Universidad de Valparaíso, 2020) Tapia Pérez, Felipe; Schmachtenberg, Oliver (Director de tesis)Las arañas son un gran grupo de artrópodos casi omnipresentes en climas cálidos y templados. Dependen de información táctil y visual para cazar y reproducirse, pero en comparación con sus sentidos mecánicos, poco se sabe acerca de sus sistemas visuales. En este estudio analizamos la sensibilidad espectral visual de la araña de rincón o araña reclusa chilena Loxosceles laeta, una especie sinantrópica que representa una amenaza importante a los humanos, utilizando registros electroretinográficos de sus tres tipos de ojos y pruebas tipo open-field con iluminación monocromática localizada para análisis de comportamiento. El electroretinograma mostró dos máximos de sensibilidad en el rango ultravioleta y verde, pero no se observaron diferencias entre los tres tipos de ojos o entre especímenes machos y hembras. La adaptación cromática selectiva redujo la sensibilidad general a la luz, pero no apoyó la posible presencia de más de un tipo de rodopsina en los fotorreceptores. La prueba open-field reveló preferencia por las esquinas por sobre los lados, y un aumento en el tiempo de exploración de las zonas abiertas iluminadas con luz de longitudes de onda corta (violeta a verde) comparado a zonas no iluminadas, no se observaron respuestas de comportamiento a luz roja o infrarroja. Esta información sugiere que L. laeta tiene visión monocromática sin especializaciones espectrales en sus tres pares de ojos secundarios.