Papel del residuo N264 en la conducción de protones a través del canal HV de Ciona intestinalis

Los canales de protones activados por voltaje (Hv) se encuentran en la membrana plasmática y compartimentos celulares de diferentes células de mamíferos, así como en células del músculo liso, esperma y células de la vía respiratoria entre otros. Sin embargo, las primeras corrientes de protones fueron descritas en neuronas de caracol. El canal fue clonado primeramente en células del sistema inmune de humano y ratón. A pesar de que el canal fue clonado en células de mamífero se encuentra también en invertebrados, como en Ciona intestinalis, en particular el canal clonado desde este invertebrado ha demostrado una muy buena expresión heteróloga en ovocitos de Xenopus leavis. Los canales clásicos dependientes de voltaje son estructuras tetraméricas, donde cada monómero consta de seis segmentos transmembrana. Los cuatro primeros corresponden al dominio sensor de voltaje (VSD) y los últimos dos segmentos de las cuatro subunidades conforman el dominio del poro, el cual es la vía de conducción del canal. Por otro lado Hv son estructuras diméricas que tiene una arquitectura en donde se aprecian cuatro segmentos transmembrana (S1-S4), los que presentan una alta homología con el VSD de los canales de K+ activados por voltaje (Kv), pero carecen de una estructura definida para la conducción de protones. Debido a que la vía de conducción de protones aun no ha sido definida. En la búsqueda de la posible vía de conducción para los protones, encontramos un residuo en el segmento S4, la asparagina 264 (N264), que podría ser parte esencial en la conducción. Este residuo se encuentra altamente conservado en los canales de protones de diversas especies, sin embargo no está presente en el VSD los canales Kv. Para establecer si la posición N264 es parte del mecanismo de conducción de protones en Hv de Ciona intestinalis, realizamos mutaciones puntuales en este residuo y se realizaron experimentos de análisis de varianza en estado no estacionario. Determinamos que la conductancia unitaria de Ci-Hv wt fue de ~200 fS. Para las mutaciones mutaciones N264C, N264Q y N264E se produjo un aumento de la conductancia de 300 fS, 2 pS y 6 pS, respectivamente. Cuando el residuo N264 se mutó por aminoácidos básicos, como lisina (N264K) y arginina (N264R) conllevan una disminución o inhibición total de la corriente, respectivamente. Al analizar el modelo de Ci-VSOP basado en un modelo por homología del sensor de voltaje (VSD) de la quimera Kv1.2-Kv2.1, se observó que la posición N264 se encuentra sobre un bolsillo hidrofílico y rodeado de aminoácido apolares en la parte más angosta de la estructura. Esto, junto con nuestros resultados experimentales, nos lleva a pensar que la posición N264 es la compuerta para el flujo de protones en Hv.